Kamis, 20 Juni 2013
Western Blot adalah proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk :
1. mengetahui keberadaan & berat Molekul protein sampel pada campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Metode Western Blotting diawali dibagi menjadi 6 tahapan yaitu :
1. preparasi sample
2. Separasi protein pada gel elektroforesis
3. transfer protein pada Membran NC atau PVDF
4. Blocking nonspesific - binding sites pada membran
5. penambahan antibodi primer, antibodi sekunder
5. deteksi atau visualisasi pengikatan antigen antibodi
Transfer protein dari gel ke membran dapat dikerjakan dengan 3 cara yaitu :
1. simple diffusion
2. Vaccum - assisted solvent flow
3. electrophoretic elution, bisa dikerjakan dengan 2 cara yaitu dengan wet transfer dan semi dry transfer
Prosedur Western Bloting ( Semi - Dry Sistem )
1. SDS - PAGE 10 -20 mA
2. Preparasi sample, terdiri atas
a. Gel ( dicuci dengan aquadest), soak ke dalam blot buffer
b. PVDF membran soak di blot buffer
c. kertas filter soak di blot buffer
3. sandwich of blot transfer, urutanya adalah :
a. kertas Filter ( 6 lembar )
b. Gel
c. Membran PVDF
d. Kertas saring ( 9 lembar )
4. Blocking dengan 5% non fat milk dalam PBST selama 1 jam
5. Cuci dalam PBST 5 menit 2-3x
6. Tambahkan Antibodi primer ( diluted dengan PBST yang berisi 5 % non fat milk) selama 1 jam s/d semalaman pada suhu 4"c
7. cuci dengan TBS 5 menit 3 - 4 x
8. antibodi sekunder dikonjugat dengan alkaline phospat selama 1 jam di suhu ruang
9. cuci dengan PBST 5 menit, 4x
10. western blue substrat solution 1 1,5 ml semalaman pada suhu ruang
11. cuci dengan aquadest
untuk lebih lengkapnya silahkan buka video di link berikut : http://www.youtube.com/watch?v=ikVsaRaFAYU
